來自美國霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所，Janelia研究園的科學(xué)家們，借助其發(fā)展的新光學(xué)超分辨率成像技術(shù)，在前所未有的高分辨率條件下研究了活體細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)生物過程。他們的新方法顯著的提高了結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(structuredilluminationmicroscopy，SIM)的分辨率， 一種最適合活體超分辨成像的技術(shù)。
新技術(shù)所拍攝的視頻生動地展現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運動和相互作用。它們幫助生物學(xué)家理解細(xì)胞是怎樣改變它們之間的依存結(jié)構(gòu)，以及重整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)使得細(xì)胞外的分子可以被吸收到細(xì)胞內(nèi)。來自Janelia研究園的研究員EricBetzig博士，李棟博士后*和他們的同事們基于原有的SIM顯微鏡原理新發(fā)展 了兩種新的超分辨率成像技術(shù)。超分辨率光學(xué)顯微成像技術(shù)能夠跨越理論的分辨率極限，在極高的分辨率下展現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu)。但是，到目前為止，超分辨率顯微鏡技術(shù)卻依然不能進(jìn)行有效的活體細(xì)胞成像。
“這些方法設(shè)立了超分辨率光學(xué)顯微鏡的成像速度和非侵入特性的新標(biāo)準(zhǔn)，它們使得超分辨率活體細(xì)胞成像成為現(xiàn)實�！盉etzig博士說道。在傳統(tǒng)的 SIM顯微鏡中，物鏡下的物體被非均勻的結(jié)構(gòu)光(類似于條紋碼)所照明。在實驗中，幾束不同的結(jié)構(gòu)光用來照明物體，它們和物體在不同角度混頻所產(chǎn)生的摩爾條紋被相機(jī)依次采集。然后計算機(jī)提取摩爾條紋編碼的信息并將其解碼生成三維的高分辨率圖像。最終重建的SIM圖像具有高于傳統(tǒng)顯微鏡圖像2倍的空間分辨率。
Betzig博士和其他兩位科學(xué)家因為發(fā)展超分辨率熒光顯微鏡而被授予2014年諾貝爾化學(xué)獎。他說道，SIM顯微鏡技術(shù)之所以沒有得到像其它方法那樣多的關(guān)注，是因為其它技術(shù)能夠提供比兩倍更高的分辨率改進(jìn)效果。但是，他強(qiáng)調(diào)SIM擁有兩大其它的超分辨率方法所沒有的優(yōu)勢。這些其它方法包括了兩種去年獲得諾貝爾獎表彰的技術(shù)：他和同事HaraldHess博士于2006年開發(fā)的光激活定位顯微鏡(photoactivatedlocalizationmicroscopy，PALM)，和受激輻射耗盡(stimulatedemissiondepletion，STED)顯微鏡。但是，這兩種技術(shù)都需要過多或過強(qiáng)的光來照明樣品，以至于熒光蛋白很快被漂白，細(xì)胞樣品很快被損害，從而不可能長時間進(jìn)行成像。然而，SIM在這些方面不一樣，“我愛上了SIM，因為它的速度很快，而且它所需的照明光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn) 小于其它方法�！盉etzig博士說道。
Betzig博士在2011年MatsGustafsson博士去世后不久開始與SIM相關(guān)的研究。Gustafsson博士是SIM技術(shù)的先驅(qū)之一，生前也是Janelia的研究員。Betzig博士那時已經(jīng)深信SIM有潛力為解析細(xì)胞內(nèi)部的工作機(jī)理提供重要的見解，如果SIM的空間分辨率可以被 提高，它對于生物研究的可用性將被大大增強(qiáng)。
在生前，Gustafsson博士和博士生HesperRego發(fā)展了一種利用飽和耗盡(saturateddepletion)的非線性SIM技術(shù)，但這種技術(shù)在改進(jìn)分辨率的同時需要使用很多的光照并且散失了SIM成像速度快的優(yōu)勢。Betzig博士想到了一種可以避免這些缺陷的方法。
飽和耗盡非線性SIM利用光可反復(fù)開關(guān)的熒光蛋白和其在開關(guān)過程中的飽和耗盡效應(yīng)來提高分辨率。它產(chǎn)生圖像的過程是，首先把所有的熒光蛋白分子激活到可發(fā)光的狀態(tài)(亮態(tài))，然后用一束結(jié)構(gòu)光把大部份的亮態(tài)分子反激活到暗態(tài)。通過結(jié)構(gòu)光反激活之后，僅有少數(shù)處于結(jié)構(gòu)光最弱區(qū)域的分子仍然保持在亮態(tài)。這些光調(diào)控過程提供了物體的高空間頻率信息，從而讓圖像更加清晰。這一過程需要重復(fù)25或更多次才能產(chǎn)生最終的高分辨率圖像。Betzig博士說道，這一原理 非常類似于STED或另一種與其相關(guān)的叫做RESOLFT的超分辨率技術(shù)的原理。
這一技術(shù)并不適合于活體成像，因為激活和反激活熒光蛋白需要很長的時間。另外，反復(fù)的光照明會對細(xì)胞和熒光蛋白本身造成損傷。Betzig博士說道， “這一技術(shù)的問題在于你首先用光激活了所有的熒光蛋白分子，然后你馬上又用另一束光反激活了大部份分子。這些被反激活的分子對最終的圖像沒有任何貢獻(xiàn)，但卻被你用光“油炸”了兩次。你讓分子承受了很大“壓力”，并且花了很多你并沒有的時間，因為這段時間內(nèi)細(xì)胞在運動�！�
解決方法其實很簡單，Betzig博士說道：“沒有必要激活所有的分子�！痹贐etzig研究小組新發(fā)展的結(jié)構(gòu)光激活非線性SIM的技術(shù)中，一開始用 結(jié)構(gòu)光只激活樣品里的一部分熒光蛋白分子�！斑@一結(jié)構(gòu)光激活過程已經(jīng)給你一些高分辨率的信息了�！盉etzig博士解釋道。另外一束結(jié)構(gòu)光用于反激活分 子，額外的信息可以在反激活的過程中同時被讀出。兩個結(jié)構(gòu)光疊加的效應(yīng)給與最終圖像62納米的分辨率，這一結(jié)果好于原始的SIM，并且把由光波長決定的傳統(tǒng)分辨率極限改進(jìn)了三倍。
“我們能夠做到快速地超高分辨率成像�！盉etzig博士說道。這很重要，他補(bǔ)充道，因為對于動態(tài)過程，單純提高空間分辨率而沒有相應(yīng)地提高成像速度是沒有意義的�！叭绻�(xì)胞內(nèi)部有的結(jié)構(gòu)以1微米每秒的速度運動，并且我有1微米的分辨率，那么我需要在一秒內(nèi)采集圖像。但如果我有1/10微米的分辨率， 那么我就必需在1/10秒內(nèi)采集圖像，不然圖像將變得模糊�！盉etzig博士解釋道。
結(jié)構(gòu)光激活非線性SIM可在1/3秒內(nèi)采集25幅原始圖像，并從中重建出一幅高分辨率圖像。它的圖像采集很高效，只需用較低的照明光強(qiáng)，并且收集每一個亮態(tài)熒光蛋白分子所攜帶的信息。從而有效地保護(hù)了熒光分子，使得顯微鏡能夠進(jìn)行更長時間的成像，讓科學(xué)家們可以觀測到更多的動態(tài)活動。
Betzig博士的團(tuán)隊利用結(jié)構(gòu)光激活非線性SIM獲得了在細(xì)胞運動和改變形狀的過程中骨架蛋白的解體和自身再組裝過程，以及在細(xì)胞膜表面的叫做caveolae的微小內(nèi)吞體動態(tài)過程的影像。
在Science論文里，Betzig博士的團(tuán)隊也利用了已經(jīng)商業(yè)化的高數(shù)值孔徑物鏡將傳統(tǒng)SIM的空間分辨率提高到84納米。高數(shù)值孔徑限制了被光照明的樣品范圍，從而降低了光對細(xì)胞以及熒光蛋白分子的損傷。這一方法可以同時對多個顏色通道進(jìn)行成像，使得科學(xué)家們可以同時跟蹤幾種不同蛋白質(zhì)的活動。
通過高數(shù)值孔徑的方法，Betzig博士的團(tuán)隊觀測了多個骨架蛋白質(zhì)在形成粘著斑(鏈接細(xì)胞內(nèi)外的物理鏈)過程中的運動和相互作用。他們也追蹤了clathrin修飾的內(nèi)吞體的成長和內(nèi)吞過程(內(nèi)吞體將細(xì)胞外的分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi))。他們的定量分析回答了幾個不能被以往的成像技術(shù)所解決的問題，例 如，內(nèi)吞體的分布，以及內(nèi)吞體尺寸和壽命之間的關(guān)系。最后，通過結(jié)合高數(shù)值孔徑方法和結(jié)構(gòu)光激活非線性SIM，Betzig博士和他的同事可以在超高分辨率條件同時追蹤兩種蛋白質(zhì)的活動。
Betzig博士的團(tuán)隊在進(jìn)一步提高他們的SIM技術(shù)。他們也急切地盼望和生物學(xué)家一起探索潛在的應(yīng)用并進(jìn)一步改進(jìn)這一技術(shù)的可用性。
現(xiàn)在，科學(xué)家們可以通過現(xiàn)在，科學(xué)家們可以通過JaneliaJanelia的高級成像中心利用這些新的的高級成像中心利用這些新的SIMSIM技 術(shù)，這個中心提供免費使用前沿的顯微鏡技術(shù)的機(jī)會。最后，技術(shù)，這個中心提供免費使用前沿的顯微鏡技術(shù)的機(jī)會。最后，BetzigBetzig博士說道， 使得博士說道，使得SIMSIM成為能夠被其他實驗室獲得并能夠承擔(dān)的技術(shù)應(yīng)該是比較直接的事。“大部份的‘魔術(shù)’在于軟件而不是硬件。”成為能夠被其他實驗室獲得并能夠承擔(dān)的技術(shù)應(yīng)該是比較直接的事。“大部份的‘魔術(shù)’在于軟件而不是硬件�！�
文章參考：儀器信息網(wǎng)
