本方法適用于鮮活水產(chǎn)品及其制品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠的檢驗(yàn)。
一、方法原理
試樣中殘留的孔雀石綠經(jīng)乙腈-乙酸鹽酸緩沖混合液提取后，經(jīng)乙腈再次提取，液液分配到二氯甲烷層并濃縮，經(jīng)酸性氧化鋁柱凈化后，高效液相色譜—二氧化鉛柱后衍生測(cè)定，外標(biāo)法定量。
二、主要儀器設(shè)備
1. 上海儀電分析高效液相色譜儀LC210，帶紫外檢測(cè)器
3.超聲波水浴
4.電熱恒溫水浴鍋
5.勻漿機(jī)
6.離心機(jī)：4 000 r/min。
7.固相萃取裝置
8.25% PbO2氧化柱：臨用前用甲醇沖洗，并將PbO2氧化柱連接在紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器
液相色譜柱之間
9.酸性氧化鋁柱：1g/3mL，使用前用5 mL乙腈活化
三、試劑
1.乙腈：色譜純
2. 二氯甲烷：分析純
3. 甲醇：色譜純
4. 乙酸鹽緩沖液：準(zhǔn)確稱(chēng)取4.95g 無(wú)水乙酸鈉及0.95g對(duì)-甲苯磺酸，溶解于950mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH至4.5， 最后用水稀釋到1L。
5. 20%鹽酸羥胺溶液。
6. 對(duì)-甲苯磺酸溶液1.0 mol/L：準(zhǔn)確稱(chēng)取17.2g對(duì)-甲苯磺酸，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，混勻。
7.乙酸銨緩沖溶液50 mmol/L：準(zhǔn)確稱(chēng)取3.85g無(wú)水乙酸銨，置于1000mL容量瓶中，用冰乙酸調(diào)pH到4.5。
8.孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的孔雀石綠，用乙腈配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。準(zhǔn)確吸取1mL 100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL棕色容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1μg/mL，于-18℃避光保存。
9.孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取0.5mL 1μg/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL棕色容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，此標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為20ng/mL，于-18℃避光保存。
四、操作步驟
1、樣品制備
1.1提取
準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入1.5 mL 20%的鹽酸羥胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L的對(duì)-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸鹽緩沖溶液，用勻漿機(jī)以10 000 r/min的速度均質(zhì)30秒，再加入10 mL乙腈劇烈震搖30 秒。加入5g酸性氧化鋁，再次震蕩30 秒。以 3 000 r/min離心10 min。將上層清液轉(zhuǎn)移至裝有10 mL 水和2 mL 二甘醇的100 mL離心管中，并加入10 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并乙腈層。
1.2凈化
在離心管中加入15 mL 二氯甲烷,振蕩10 秒，3 000 r/min離心10 min， 將二氯甲烷層轉(zhuǎn)移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重復(fù)上述操作一次，合并二氯甲烷層，收集于100 mL梨形瓶中。45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL，用2.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?nbsp;
將酸性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，將梨形瓶中的溶液轉(zhuǎn)移到固相萃取柱上，再用乙腈洗滌瓶?jī)纱�，每�?.5 mL，將洗滌液依次通過(guò)酸性氧化鋁柱，控制流速不超過(guò)0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，準(zhǔn)確加入0.5 mL乙腈溶解，過(guò)0.45μm 濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定
2、高效液相色譜儀參考條件
色譜柱：C18 4.6 mm(i.d)×250mm，在C18色譜柱和檢測(cè)器之間連接二氧化鉛氧化柱；
流動(dòng)相：乙腈+乙酸銨緩沖溶液(60+40)
流速：1 mL/min；
柱溫：室溫
波長(zhǎng)：618 nm；
測(cè)定：取相同體積試樣制備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液分別注入高效液相色譜儀，根據(jù)保留時(shí)間按定性，外標(biāo)峰面積法定量。
3、結(jié)果計(jì)算
試樣中孔雀石綠的殘留量按下式進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。
X=（C*A*V）/(W*As )
式中：
X——樣品中孔雀石綠的殘留量，單位為mg/kg；
C——孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度，單位為ug/mL；
A——樣品中孔雀石綠的峰面積；
As——孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液的峰面積；
V——樣液最終定容體積，單位為毫升mL
W——最終樣液所代表的試樣量，單位為g；
本方法孔雀石綠的殘留量測(cè)定結(jié)果系指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量的之和，以孔雀石綠表示
4、備注：
參考色譜圖：
10ng/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液
保留時(shí)間 | 名稱(chēng) | 峰面積 | 峰高 | 半高峰寬 | 理論塔板數(shù) |
5.276 | 孔雀石綠 | 918 | 110 | 7.836 | 9326 |
20ng/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液
保留時(shí)間 | 名稱(chēng) | 峰面積 | 峰高 | 半高峰寬 | 理論塔板數(shù) |
5.287 | 孔雀石綠 | 1866 | 208 | 8.423 | 8110 |
