摘要
本文通過在線光化學(xué)衍生-高效液相色譜法，同時(shí)測(cè)定火鍋底料中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B。樣品經(jīng)丙酮和乙腈的混合溶液（V:V/2:8）提取、C18固相萃取柱凈化、高效液相色譜分離后，4種蘇丹紅染料在紫外光的照射下發(fā)生衍生反應(yīng)，衍生產(chǎn)物進(jìn)入熒光檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。
1 前言
"蘇丹紅"是一種化學(xué)染色劑，并非食品添加劑。它的化學(xué)成份中含有一種叫萘的化合物，該物質(zhì)具有偶氮結(jié)構(gòu)，由于這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定了它具有致癌性，對(duì)人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用。蘇丹紅屬于化工染色劑，主要是用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。由于用蘇丹紅染色后的食品顏色鮮艷且不易褪色，一些不法食品企業(yè)把蘇丹紅作為色素添加到食品中。
食品中蘇丹紅染料分析方法有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜法和氣相色譜質(zhì)譜法等。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19681-2005采用高效液相色譜-紫外法測(cè)定食品中的蘇丹紅，該方法靈敏度較低，在測(cè)定時(shí)需要切換掃描波長(zhǎng)，不利于操作。熒光檢測(cè)法具有選擇性好、靈敏度高，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，在分析科學(xué)及其它相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多，而蘇丹紅的熒光響應(yīng)較低，以熒光檢測(cè)法測(cè)定時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行衍生，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強(qiáng)熒光響應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
光化學(xué)反應(yīng)是待測(cè)物質(zhì)在可見光或紫外光的照射下而產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)，待測(cè)物質(zhì)的分子吸收光子后結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變或者與試劑產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，與化學(xué)衍生反應(yīng)相比，具有不需要使用額外的衍生試劑，污染較小，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛的應(yīng)用于黃曲霉毒素的測(cè)定中，目前將光化學(xué)衍生應(yīng)用于蘇丹紅殘留測(cè)定的文章鮮見報(bào)道。
本文針對(duì)火鍋底料樣品，采用C18固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行濃縮、凈化，建立了光化學(xué)衍生-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定火鍋底料中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的方法，該方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
2 材料與方法
2.1 儀器及設(shè)備
高效液相色譜儀（主要包括熒光檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器等）；
光化學(xué)衍生器（由紫外燈、聚四氟乙烯反應(yīng)管組成）；超生波清洗機(jī)；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；氮?dú)獯蹈蓛x；C18(500mg/6mL)固相萃取柱。
2.2 試劑
乙腈、甲醇和丙酮，色譜純；無(wú)水硫酸鈉，分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Millpore超純水；
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：蘇丹紅Ⅰ(純度≥99.0%)，蘇丹紅Ⅱ(純度≥99.0%)，蘇丹紅Ⅲ(純度≥96.0%)，蘇丹紅B(純度≥90.0%)。
2.3 分析測(cè)定條件
色譜柱： C18 (250mm×4.6mm ,5μm)；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲醇，梯度洗脫：0~11min，100% A；11~12min，100% A~0%A，0%B~100%B；12~25min，100% B；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；柱溫：30℃；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)310nm，發(fā)射波長(zhǎng)348nm。
2.4 樣品前處理
2.4.1 樣品的提取
稱取2.0g試樣于50.0mL離心管中，加入5.0g無(wú)水Na2SO4， 20.0mL丙酮-乙腈（V:V/2:8）溶液，超聲提取20min，以5000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至250mL雞心瓶中，殘留物用20.0mL丙酮-乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并上清液，并在40℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1mL，待凈化。
2.4.2 固相萃取柱富集凈化
C18固相萃取柱依次用5mL乙腈、5mL水進(jìn)行活化和平衡，然后將上述待凈化液上樣過柱，用1mL丙酮-乙腈溶液潤(rùn)洗雞心瓶，并將潤(rùn)洗液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用5mL水淋洗，再用5mL丙酮-乙腈溶液進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液，氮?dú)獯蹈�，用丙�?乙腈溶液重新定容至1mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。
2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B，加入少量丙酮超聲溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用乙腈稀釋成濃度為0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置于4℃冰箱中避光保存。臨用前，分別準(zhǔn)確吸取一定體積的0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈逐級(jí)稀釋到相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.結(jié)果與討論
3.1 掃描波長(zhǎng)的選擇
采用熒光檢測(cè)器自帶的3D掃描功能分別在波長(zhǎng)200-340nm、330-600nm范圍內(nèi)掃描4種蘇丹紅光化學(xué)衍生產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，從掃描結(jié)果圖中看出，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B經(jīng)光化學(xué)衍生后其衍生產(chǎn)物的最佳激發(fā)波長(zhǎng)分別為312nm，312nm，305nm，305nm；最佳發(fā)射波長(zhǎng)均為348nm，因此本文選擇激發(fā)波長(zhǎng)310nm發(fā)射波長(zhǎng)348nm作為掃描波長(zhǎng)對(duì)4種蘇丹紅進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。
3.2檢測(cè)方法的選擇
分別采用熒光檢測(cè)器和柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)器對(duì)相同濃度的4種蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖2。從圖中可以看出，采用熒光檢測(cè)器測(cè)定時(shí)4種蘇丹紅僅表現(xiàn)出微弱的熒光響應(yīng)，不利于痕量組分含量的測(cè)定；經(jīng)光化學(xué)衍生后4種蘇丹紅的熒光響應(yīng)大為增加，這是由于蘇丹紅是一類萘酚偶氮結(jié)構(gòu)型染料，其分子結(jié)構(gòu)中的偶氮基團(tuán)具有光化學(xué)活性，在光照作用下能夠發(fā)生順式和反式結(jié)構(gòu)的互變，甚至能夠與溶劑發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致偶氮化合物的性質(zhì)發(fā)生顯著的變化，生成具有較強(qiáng)熒光響應(yīng)的物質(zhì)。
3.3 流動(dòng)相的選擇
分別以乙腈、甲醇、乙腈-水（V:V/98：2）、甲醇-水（V:V/98：2）、乙腈-甲醇（V:V/98：2）為流動(dòng)相等度洗脫，光化學(xué)衍生后測(cè)定，考察4種蘇丹紅的出峰及分離情況。
以乙腈為流動(dòng)相時(shí)，4種蘇丹紅均能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，且4種蘇丹紅具有很好的分離度；以甲醇為流動(dòng)相時(shí)，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ僅有微弱的熒光響應(yīng)，響應(yīng)值較低，難以滿足蘇丹紅殘留的檢測(cè)要求，蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B具有較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，與乙腈為流動(dòng)相相比其響應(yīng)值更高；
以乙腈-水（V:V/98：2）、甲醇-水（V:V/98：2）、乙腈-甲醇（V:V/98：2）為流動(dòng)相時(shí)，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ的熒光響應(yīng)均較弱，與未發(fā)生光化學(xué)衍生反應(yīng)測(cè)定的響應(yīng)值相近。
上述實(shí)驗(yàn)表明蘇丹紅的光化學(xué)衍生反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的熒光性質(zhì)與參加反應(yīng)的溶劑相關(guān)，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ在純乙腈條件下才能發(fā)生光化學(xué)衍生反應(yīng)，當(dāng)流動(dòng)相中含有微量的水和甲醇時(shí)都會(huì)影響其光化學(xué)反應(yīng)；蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B與甲醇和乙腈均能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，微量的水不影響這兩者的光化學(xué)反應(yīng)，而且在甲醇流動(dòng)相中兩者的光化學(xué)衍生產(chǎn)物的熒光響應(yīng)值更高。
主要原因是隨著蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B分子結(jié)構(gòu)中共軛體系的增大，分子極性減弱，從而在極性較弱的甲醇中表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。因此分別選擇乙腈和甲醇為光化學(xué)反應(yīng)的溶劑，采用梯度洗脫的方法對(duì)4種蘇丹紅進(jìn)行分離和測(cè)定。
3.4 樣品前處理?xiàng)l件的選擇
現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蘇丹紅時(shí)通常采用乙腈直接提取或者氧化鋁層析柱凈化的方法進(jìn)行樣品前處理，而前者容易受到樣品基質(zhì)的影響，提取后存在大量的干擾物質(zhì)，影響目標(biāo)物質(zhì)的定性和定量；后者處理方法較為繁瑣，氧化鋁的活性對(duì)方法回收率的影響很大。圖4為空白樣品和加標(biāo)樣品采用C18固相萃取柱凈化后測(cè)定的色譜圖。
實(shí)驗(yàn)表明，C18固相萃取柱對(duì)4種蘇丹紅具有很好的保留作用，以水為淋洗液可以一次性去除樣品中大部分水溶性干擾物質(zhì)，減少雜質(zhì)對(duì)蘇丹紅檢測(cè)結(jié)果的影響，同時(shí)采用C18固相萃取柱進(jìn)行樣品前處理，對(duì)待測(cè)組分還具有濃縮和富集的作用，有利于降低待測(cè)組分的檢出限。
3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限
分別準(zhǔn)確吸取適量體積的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈逐級(jí)稀釋成一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y，μV·s）對(duì)質(zhì)量濃度(x，μg /mL)作圖，得線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(R2)。向陰性火鍋底料樣品中添加低濃度水平的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法進(jìn)行樣品前處理后上機(jī)檢測(cè)，以S/N=3為檢出限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ）。
結(jié)果表明，采用外標(biāo)峰面積法定量，4種蘇丹紅在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。與國(guó)標(biāo)方法相比，可較好地減少樣品濃縮、凈化等樣品前處理過程帶來(lái)的誤差，該方法線性范圍寬，檢出限低，可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)。
3.6 回收率和精密度
向陰性火鍋底料樣品中分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并以上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定, 考察實(shí)驗(yàn)方法的回收率，并對(duì)加標(biāo)樣品重復(fù)測(cè)定6次，考察實(shí)驗(yàn)方法的精密度。結(jié)果表明，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的回收率均在85%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.58%~4.36%�；厥章屎途芏冉Y(jié)果編制成表。
4 結(jié)論
本文以C18固相萃取柱凈化樣品，富集蘇丹紅染料，并基于紫外光照射能夠增強(qiáng)蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的熒光響應(yīng)，建立了光化學(xué)衍生-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定火鍋底料中4種蘇丹紅染料的方法。該方法能夠有效去除樣品中雜質(zhì)干擾，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于火鍋底料中蘇丹紅殘留的分析檢測(cè)。
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