一、概述
高效液相色譜方法的開發(fā)過程中，一個(gè)總的原則是：先找到目標(biāo)化合物的峰，然后調(diào)整峰形，再是進(jìn)一步完善。本文主要介紹調(diào)整峰形中峰形前拖的解決方案。
二、峰形前拖問題簡(jiǎn)介
峰形對(duì)稱性的優(yōu)劣對(duì)峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，是色譜工作者不得不重視的問題，也是讓大家最為頭疼的問題之一。然而引起峰形異常的因素很多，如色譜柱本身裝填不好、強(qiáng)保留化合物對(duì)色譜柱的污染、填料中殘留硅羥基引起的次級(jí)保留效應(yīng)、柱頭塌陷、柱外死體積等等，針對(duì)不同的情況我們可以有不同的對(duì)策。在這里我們撇開所有的污染、塌陷、死體積等其它因素，假設(shè)系統(tǒng)是好的，柱子是新的、好的，單純探討液相方法與峰形前拖之間的關(guān)系，通過調(diào)整液相方法來解決峰形前拖的問題。
前拖峰在譜圖上有幾種表現(xiàn)形式，主要有以下3種，第一種比較明顯一些，后兩種，容易讓人懷疑這個(gè)峰里面是不是有兩種物質(zhì)沒有徹底的分開，第三種前拖更是讓人質(zhì)疑是否是色譜柱受到了污染引起的肩峰。
三、峰形前拖問題消除方法
發(fā)現(xiàn)峰形前拖時(shí)，建議按下面的步驟逐步排除可能的原因，然后找到相應(yīng)的對(duì)策，消除峰形前拖的狀況、改善峰形。
1、先檢查一下是否是樣品過載
樣品過載，通常會(huì)引起峰形變差，導(dǎo)致前拖、后拖或平頭峰，如果出現(xiàn)平頭峰、峰高超過2000mAU或峰很高的同時(shí)又前拖、后拖得很厲害通常都認(rèn)為是過載的，但這一點(diǎn)也并不絕對(duì)，因?yàn)椴煌衔锏奈諒?qiáng)度不一樣，如果一種化合物在某一波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，即使出現(xiàn)了平頭峰，樣品也不一定過載；相反如果吸收弱，則高濃度條件下峰也不見得有多高；所以樣品是否過載應(yīng)該結(jié)合濃度、進(jìn)樣體積和峰形一起來判斷。通常認(rèn)為峰高在100mAU左右比較合適，不至于因過載影響峰形。由于樣品過載引起的峰形前拖不容易消除，也可能根本無法消除，繼續(xù)采用以下的峰形改善措施可能不會(huì)有什么作用，而且在過載的情況下無法看清正常濃度時(shí)樣品真實(shí)的分離狀況和峰形，因此需要優(yōu)先考慮是否過載，否則繼續(xù)往下調(diào)整峰形的努力將無任何意義。
2、檢查是否是用流動(dòng)相溶解樣
不用流動(dòng)相溶解樣品容易在譜圖上產(chǎn)生溶劑峰和前拖（上述的幾種形狀的前拖都有），這種情況通常是在溶解樣品的溶劑（如純甲醇）洗脫能力比流動(dòng)相（如甲醇：0.4%磷酸溶液＝38：62）強(qiáng)的情況下發(fā)生，如例2，而溶劑洗脫能力比流動(dòng)相相對(duì)較弱時(shí)，目前未見此現(xiàn)象；也有人說也會(huì)產(chǎn)生后拖，但本人做樣以來并沒有碰到過這種的情況。
正常的峰形應(yīng)該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的，濃度分布在整個(gè)通過色譜柱柱床的過程中任何時(shí)候都呈正態(tài)分布。
為什么用洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)的溶劑溶解樣品會(huì)容易產(chǎn)生前拖？
一種可能的解釋是，進(jìn)針后，在流動(dòng)相的推動(dòng)下樣品溶液很快到達(dá)色譜柱，此時(shí)樣品溶液未能被流動(dòng)相很快稀釋，結(jié)果是，作為樣品溶劑的局部濃度過大，由于甲醇的洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)，因此甲醇帶著部分樣品提前進(jìn)入到了填料里面，而另一部分則還沒來得及進(jìn)入填料周圍的環(huán)境就發(fā)生了變化——由甲醇變成了流動(dòng)相，所以一部分樣品提前被甲醇帶出來而另一部分沒有，導(dǎo)致樣品譜帶的濃度分布發(fā)生了變化，濃度中心偏離了正常峰時(shí)的位置。同時(shí)作為樣品溶劑的甲醇畢竟有限，只有幾十微升，因此只能帶著很少一部分樣品提前進(jìn)入填料，形成前拖。
根據(jù)這一解釋，出現(xiàn)這種前拖時(shí)，似乎樣品只有在周圍環(huán)境與流動(dòng)相相同時(shí)才不會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象，如果用甲醇溶解的樣品濃度為10ug/ml時(shí)出現(xiàn)前拖（此時(shí)樣品周圍環(huán)境與流動(dòng)相不同），那么將1000ug/ml高濃度甲醇溶解的樣品用流動(dòng)相稀釋至原來濃度的1/100倍（此時(shí)樣品的濃度也為10ug/ml，周圍環(huán)境與流動(dòng)相也不完全相同），是不是也會(huì)出現(xiàn)前拖呢？很顯然不會(huì)，因?yàn)樗陀昧鲃?dòng)相溶解已經(jīng)沒有什么區(qū)別，差異太小了，只有1/100。也就是說不一定非得用流動(dòng)相溶解樣品才會(huì)消除這種因樣品溶劑而引起的前拖，那么到底要與流動(dòng)相差異多小才不會(huì)引起這種狀況呢？在我們的實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，只要用流動(dòng)相將原樣品稀釋至原來濃度的1/4倍（體積比，原樣品溶液：流動(dòng)相＝1：3混合）就可以達(dá)到和用流動(dòng)相溶解相似的效果。
由此可以看出，不用流動(dòng)相溶解樣品對(duì)色譜峰形是有很大影響的，容易造成前拖，所以特別是開發(fā)方法的時(shí)候盡量使用流動(dòng)相來溶解樣品。當(dāng)然，如果已經(jīng)用了較強(qiáng)的溶劑溶解樣品，得到了一個(gè)前拖峰，而重新用流動(dòng)相配制樣品又很麻煩時(shí)，那么可以用流動(dòng)相將樣品稀釋至原來濃度的1/4倍，來粗略的考查一下，看是否是因未用流動(dòng)相溶解引起的。事實(shí)上，一直以來我們?cè)诳疾榉逍吻把右鸬脑虻臅r(shí)候經(jīng)常用這種更便捷的方式，省了不少時(shí)間，非常管用。
有時(shí)候同樣是用強(qiáng)溶劑溶解的在有些色譜柱中產(chǎn)生前拖，而另一些色譜柱中沒有，我個(gè)人認(rèn)為，這些填料可能是沒有封尾的，從填料鍵合的角度，裸硅膠上鍵合上C18長(zhǎng)鏈后仍然殘留了大量的硅羥基，殘留的硅羥基對(duì)水分子具有很強(qiáng)的吸附能力，硅膠表面的吸附水對(duì)所進(jìn)的樣品溶液產(chǎn)生了一種稀釋作用，使附帶樣品的甲醇失去了相對(duì)較強(qiáng)的洗脫能力，不再能很快帶著部分樣品進(jìn)入填料，而是均勻的進(jìn)到色譜填料中，樣品在色譜柱中的濃度分布未能產(chǎn)生偏移，因而出來的是正常峰。
如果峰形仍然前拖則繼續(xù)往下調(diào)整。
3、增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度
增加緩沖鹽濃度可以增大流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度，減少因靜電的作用（有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間）引起的前拖。
4、流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃
往流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃有時(shí)可以改善峰形、增大分離度，很多色譜工作者都知道和使用，但其機(jī)理似乎少人提及。通常所加入的量在5％以內(nèi)即可，需要的時(shí)候可以加入更大的量。
5、升高柱溫的溫度
升溫有助于增加流動(dòng)相傳質(zhì)速率，減少因靜電作用引起的前拖，但溫度不宜太高，溫度太高容易損傷色譜柱，特別是含有離子對(duì)試劑的時(shí)候，最好不要超過40度。
（內(nèi)容來源儀器信息網(wǎng)）
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